Какая техника может быть использована для ИК-визуализации биологических образцов? Освоение ИК-Фурье микроспектроскопии для химического картирования

Для инфракрасной (ИК) визуализации биологических образцов наиболее широко используемой и мощной техникой является Фурье-преобразовательная инфракрасная (ИК-Фурье) микроспектроскопия. Этот метод сочетает стандартный ИК-спектрометр с микроскопом, что позволяет генерировать химически специфические изображения, которые показывают пространственное распределение ключевых биомолекул, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, в срезе ткани или группе клеток.

Основная проблема ИК-визуализации в биологии заключается не только в выборе метода, но и в управлении подавляющим ИК-сигналом от воды, который может маскировать искомые молекулярные данные. Поэтому ваш выбор как прибора, так и метода подготовки образца имеет решающее значение для успеха.

Что такое инфракрасная визуализация? Химическая карта

Инфракрасная визуализация, также известная как вибрационная микроспектроскопия, принципиально отличается от стандартной оптической микроскопии. Вместо простого визуального отображения морфологии она предоставляет информацию о химическом составе образца.

Больше, чем просто изображение: создание гиперспектрального изображения

ИК-микроскоп измеряет полный инфракрасный спектр в каждом отдельном пикселе изображения. Это создает «гиперспектральный куб данных», который представляет собой стопку изображений, где каждый слой соответствует поглощению света на определенной ИК-частоте.

Анализируя эти данные, вы можете генерировать псевдоцветные изображения, которые отображают концентрацию и распределение конкретных химических компонентов по всему образцу.

Область «отпечатков пальцев»: идентификация ключевых молекул

Среднеинфракрасная область спектра (приблизительно 4000-400 см⁻¹) заставляет молекулы вибрировать. Различные химические связи (например, C=O в белках, C-H в липидах) вибрируют на характерных частотах.

Область примерно от 1800 до 900 см⁻¹ известна как «область отпечатков пальцев», потому что она содержит сложный набор пиков, уникальный для конкретной молекулы. Анализируя эту область, вы можете идентифицировать и количественно определить основные классы биомолекул.

Доминирующая техника: ИК-Фурье микроспектроскопия

Хотя существуют и другие методы, ИК-Фурье микроспектроскопия является основным инструментом в этой области благодаря балансу чувствительности, скорости и универсальности.

Почему ИК-Фурье? Скорость и чувствительность

Современные Фурье-преобразовательные инфракрасные (ИК-Фурье) приборы собирают все частоты света одновременно, что является значительным преимуществом по сравнению со старыми методами. Это приводит к гораздо более высокому отношению сигнал/шум и значительно более быстрому времени сбора данных, что важно для картирования больших областей биологического образца.

Преимущество «микро»: пространственное разрешение

Сочетание ИК-Фурье спектрометра с микроскопом позволяет сфокусировать ИК-луч в небольшую точку. Растровое сканирование этого луча по образцу или использование детектора с фокальной плоскостью (FPA) позволяет построить гиперспектральное изображение пиксель за пикселем, разрешая объекты размером от десятков микрон до нескольких микрон.

Основная проблема: преодоление интерференции воды

Самым большим препятствием в ИК-анализе биологических образцов является вода.

Почему вода является проблемой

Жидкая H₂O имеет чрезвычайно сильные и широкие полосы поглощения в среднеинфракрасном диапазоне, особенно около 1640 см⁻¹. Этот сигнал настолько интенсивен, что он может полностью насытить детектор и замаскировать критическую полосу Амид I белков, которая необходима для изучения структуры и концентрации белков.

Решение 1: Сушка и фиксация образца

Наиболее распространенный подход заключается в удалении воды. Биологические ткани обычно разрезают с помощью микротома, помещают на специальное ИК-прозрачное предметное стекло (например, CaF₂ или BaF₂), а затем сушат.

Это можно сделать путем сушки на воздухе, сублимационной сушки (лиофилизации) или использования химических фиксаторов, таких как формалин или этанол, аналогично стандартной гистологии. Это эффективно устраняет сигнал воды, обеспечивая чистые, высококачественные спектры оставшихся биомолекул.

Решение 2: Изотопный обмен с тяжелой водой (D₂O)

Для изучения образцов в более «нативном» или гидратированном состоянии, таких как живые клетки, H₂O может быть заменена на оксид дейтерия (D₂O), или «тяжелую воду».

Связь O-D в D₂O поглощает на гораздо более низкой частоте (около 1210 см⁻¹), смещая массивный пик воды в сторону и выявляя сигналы белков, липидов и нуклеиновых кислот в области отпечатков пальцев.

Понимание компромиссов: режимы измерения

То, как ИК-свет взаимодействует с вашим образцом, является еще одним критическим выбором, причем каждый режим предлагает свои преимущества.

Пропускание

В режиме пропускания ИК-луч проходит непосредственно сквозь очень тонкий образец. Этот режим обычно обеспечивает самые высококачественные, наиболее поддающиеся количественной оценке спектры, но требует тщательно подготовленных, тонких срезов тканей (обычно 5-10 мкм).

Отражение (трансфлексия)

Чаще образцы анализируются в режиме трансфлексии. Ткань помещается на отражающее предметное стекло (например, зеркальное или Low-e). ИК-луч проходит через образец, отражается от поверхности предметного стекла и возвращается через образец к детектору. Это более удобно, но иногда может вносить спектральные артефакты.

Ослабленное полное внутреннее отражение (ОПВО)

ИК-Фурье визуализация с ОПВО — это мощная поверхностно-чувствительная техника. Образец приводится в плотный контакт с кристаллом с высоким показателем преломления (например, германием). ИК-свет не проходит через образец; вместо этого «исчезающая волна» проникает всего на несколько микрон в поверхность образца.

Это отлично подходит для получения высококачественных спектров с поверхности толстых или сильно поглощающих образцов без какой-либо подготовки. Его короткий путь прохождения естественным образом минимизирует интерференцию воды, что делает его сильным выбором для анализа гидратированных образцов.

Новые горизонты в ИК-биовизуализации

Область постоянно развивается благодаря новым технологиям, которые расширяют границы скорости и разрешения.

Синхротронный ИК: для максимального разрешения

Использование синхротронного источника света обеспечивает ИК-луч, который до 1000 раз ярче, чем обычный тепловой источник. Это позволяет достичь пространственного разрешения, ограниченного дифракцией, что дает возможность химической визуализации отдельных клеток и даже субклеточных органелл.

Лазеры на квантовых каскадах (QCL): для беспрецедентной скорости

Вместо широкого теплового источника эти системы используют мощные, перестраиваемые лазеры. Хотя они обычно не собирают полный спектр, их можно настроить на несколько ключевых частот для картирования специфических молекул (например, общего белка или липидов) на очень больших площадях за считанные минуты, а не часы. Это преобразует потенциал для высокопроизводительных клинических применений.

Правильный выбор для вашей цели

Выбор техники и подготовки образца полностью зависит от вашего исследовательского вопроса.

• Если ваша основная цель — диагностическая гистопатология: используйте ИК-Фурье микроспектроскопию в режиме пропускания или трансфлексии на тонких, высушенных и фиксированных срезах тканей для идентификации биохимических маркеров заболевания.
• Если ваша основная цель — изучение живых клеток или динамических процессов: рассмотрите ИК-Фурье визуализацию с ОПВО или работу в герметичной жидкостной ячейке после замены среды на D₂O для поддержания гидратированной среды.
• Если ваша основная цель — субклеточный химический анализ: вам, вероятно, потребуется высокая яркость и пространственное разрешение, обеспечиваемые синхротронным ИК-источником.
• Если ваша основная цель — высокопроизводительный скрининг множества образцов: визуализация на основе QCL предлагает скорость, необходимую для быстрого картирования распределения нескольких ключевых биомаркеров.

В конечном итоге, освоение инфракрасной визуализации биологических образцов заключается в контроле ваших переменных для выделения молекулярных сигналов, которые имеют наибольшее значение.

Сводная таблица:

Техника	Ключевое преимущество	Лучше всего подходит для
ИК-Фурье микроспектроскопия	Высокая чувствительность и скорость	Общее химическое картирование тканей
ИК-Фурье визуализация с ОПВО	Минимальная подготовка образца, чувствительность к поверхности	Гидратированные образцы, живые клетки
Синхротронный ИК	Максимальное пространственное разрешение	Субклеточный анализ
QCL-визуализация	Беспрецедентная скорость	Высокопроизводительный скрининг

Готовы раскрыть весь потенциал ИК-визуализации в своих исследованиях? KINTEK специализируется на предоставлении передового лабораторного оборудования и расходных материалов для всех ваших потребностей в ИК-Фурье и биологической визуализации. Независимо от того, работаете ли вы с тканевыми срезами, живыми клетками или нуждаетесь в высокопроизводительных решениях, наши эксперты помогут вам выбрать правильные инструменты для достижения точных, химически специфических результатов. Свяжитесь с нами сегодня, чтобы обсудить, как мы можем поддержать успех вашей лаборатории!